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SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，使用方法

更新時(shí)間：2019-08-22 點(diǎn)擊次數(shù)：1981次

　　SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，使用方法；

　　1、您收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：

　　取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮*培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。

　　2、細(xì)胞傳代：

　　1)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

　　2)添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀(guān)察，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

　　3)棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml*培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，后放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

　　4)待細(xì)胞*貼壁后，觀(guān)察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。

　　3、細(xì)胞凍存：

　　1)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

　　2)添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀(guān)察，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

　　3)用適量的凍存液(FBS：DMSO=9 ：1)重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

　　4)先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過(guò)夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。

　　4、細(xì)胞復(fù)蘇：

　　1)從液氮中取出細(xì)胞凍存管(注意：佩戴防爆管面具)，快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

　　2)將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml*培養(yǎng)基的15ml離心管中， 1000rpm離心5min；

　　3)棄上清，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

　　4)第二天，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

　　SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，細(xì)胞傳代：收到細(xì)胞后，請(qǐng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶外表進(jìn)行消毒，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行 1-2 小時(shí)的緩沖，待細(xì)胞恢復(fù)基本生長(zhǎng)狀態(tài)后，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在倒置顯微鏡下觀(guān)察整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況：

　　(一)細(xì)胞未長(zhǎng)至 85%時(shí)，用 75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到生物操作臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格無(wú)菌操作，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，若培養(yǎng)瓶上無(wú)特殊標(biāo)注，吸去剩余培養(yǎng)液，只留 6-8ml 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

　　(二)細(xì)胞已長(zhǎng)滿(mǎn)(達(dá) 85-95%)。即可進(jìn)行傳代，具體步驟如下：

　　1.棄去培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌 1-2 次，

　　2.加入 1.0ml 胰酶消化液，37℃消化，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞回縮變圓、透亮、輕拍甁壁呈流沙樣脫落，則迅速拿回操作臺(tái)，加入雙倍的含 10%血清的*培養(yǎng)液，終止消化并輕輕吹打細(xì)胞，使其變成單細(xì)胞懸液，

　　3.將細(xì)胞收集于離心管中離心 1000rmp/5min，棄上清，輕彈管底，將細(xì)胞彈散，

　　4.加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代、凍存，

　　5.如果沒(méi)有特別說(shuō)明，建議收到細(xì)胞后的次傳代比例為 1:2。

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